7+：公共数据库挖掘+肝细胞癌

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原文转自：一起实验网
早！今天小编和大家分析一篇22年11
月发表在Cells（IF:
7.666）杂志的文章。作者基于一系列公共数据库的数据挖掘，评估了lnc-RAB11B-AS1及其靶向RAB11B
mRNA和RAB11B
蛋白的表达，并探索了Lnc-RAB11B-AS1在肝细胞癌（HCC）发展和预后中的作用、Lnc-RAB11B-AS1和HCC免疫微环境及抗癌药物敏感性的关联。
背景：

HCC是一种常见的恶性肿瘤，发生在消化道，进展快，复发率高，预后差，已成为中国第四大常见恶性肿瘤和第二大致死原因。肝癌早期诊断的敏感性和特异性仍然较低，大多数肝癌患者在中期甚至晚期才被诊断出来。长非编码RNA（lncRNA），是没有蛋白质编码功能的RNA，属于非编码分子转录本家族。lncRNA已被确定对多种生物过程有影响，例如多种癌细胞的增殖，凋亡，侵袭，迁移，转移和上皮-间充质转化。RAB蛋白家族属于真核生物中一组高度保守的小GTP结合蛋白，是RAS超家族的重要成员。Rab11亚家族的不同成员失调，可以调节多种癌症的侵袭性和转移性，包括骨肉瘤、肺癌、胃癌和肾细胞癌。lnc-RAB11B-AS1对其相邻基因RAB11B具有调节作用。探究lnc-RAB11B-AS1调控相关的潜在机制，可能对寻找新的HCC生物标志物具有重要意义。
方法：


1. TCGA数据库下载HCC患者转录组测序数据和临床数据。GEO数据库下载HCC数据集GSE144269和GSE84402。
2. 免疫组织化学（IHC）测定HCC组织中RAB11B 蛋白表达。
3. 通过GeneMANIA在线网站，构建RAB11B 的与其他功能蛋白的蛋白质-蛋白质相互作用。
4. 人类蛋白质图谱（HPA）数据库探讨RAB11B和其他簇细胞标记基因在不同单细胞类型中的表达模式。
5. 筛选 lnc-RAB11B-AS1 共表达基因，并对共表达基因进行GO和KEGG富集分析。
6. 对lnc-RAB11B-AS1进行GSEA分析，探究其可能调控的分子信号通路。
7. TIMER数据库探索lnc-RAB11B-AS1、RAB11B 与肿瘤免疫细胞浸润之间的关联。
8. cBioportal数据库探索HCC中lnc-RAB11B-AS1 和 RAB11B 的突变。
9. 分析了lnc-RAB11B-AS1表达与甲基化之间的关系。
10. 对lnc-RAB11B-AS1及相关药物进行药物敏感性分析。
11. miRWalk和ENCORI数据库预测lnc-RAB11B-AS1和RAB11B靶向的miRNA。
研究结果：

1.Lnc-RAB11B-AS1在HCC中的表达量
为探究lnc-RAB11B-AS1和RAB11B在HCC中的表达状态，TCGA-HCC和GEO数据集中lnc-RAB11B-AS1和RAB11B在HCC组织中的表达水平明显低于正常组织（如图1A-F）。lnc-RAB11B-AS1与TCGA-HCC和GEO数据集中的RAB11B呈正相关关系（如图1G-F）。



2.过表达lnc-RAB11B-AS1和RAB11B对临床病理特征的影响
HCC中的lnc-RAB11B-AS1高表达组有较低的临床分期水平，
N
阶段和组织学分期。lnc-RAB11B-AS1高组和低组的AFP（p
= 0.018）和T-Bil（p
=
0.034）值差异显著（如表1）。推测高lnc-RAB11B-AS1表达HCC患者的临床结局更好。lnc-RAB11B-AS1的同源基因RAB11B，与组织学分级程度呈负相关（如表2）。通过R包“gg-plot”可视化lnc-RAB11B-AS1和RAB11B在不同临床分期和组织学分级的HCC患者中的表达模式。两种基因表达较低的患者的组织学分级和临床分期往往较高（如图2A-D）









3.lnc-RAB11B-AS1表达与肝癌患者预后的关系
Kaplan-Meier分析表明，lnc-RAB11B-AS1、RAB11B表达低的患者总生存期（OS）明显降低（如图2E-H）。使用Kaplan-Meier
分析评估了RAB11B对HCC的预后意义，预后数据显示，RAB11B表达较高的HCC患者的OS、疾病特异性生存期（DSS）、无进展生存期（PFS）和无复发生存期（RFS）时间更长，而RAB11B表达低的患者生存结局更差（如图2I)。



4.Cox回归模型分析
基于TCGA-HCC数据进行单因素和多因素Cox回归分析，探讨影响HCC患者预后的潜在危险因素。在单因素Cox回归分析中，临床分期、T
期、N
阶段、M
阶段、肌酐、
lnc-RAB11B-AS1
和RAB11B与HCC患者的总生存率有关。在多变量Cox回归分析中进一步纳入了单变量分析中具有统计学意义的变量，结果表明，lnc-RAB11B-AS1和RAB11B的低表达，晚期临床阶段、更高的N阶段和肌酐与较差的OS相关。（如表3）



5.RAB11B蛋白表达的外部验证和肝癌患者的临床病理特征
使用免疫组织化学检测了90个HCC组织切片中RAB11B的表达，免疫染色主要位于HCC细胞的细胞质中（如图3A-B）。基于细胞质染色的评分标准，与相应的非癌性组织相比，HCC组织中RAB11B在蛋白质水平上的表达显著降低，这与公共数据库中的预测结果一致。研究了90例HCC患者RAB11B蛋白表达与临床病理特征的关系（如表4)。发现RAB11B表达与病理分级呈负相关，即RAB11B表达较高的HCC患者病理分级较低。与RAB11B低表达组相比，RAB11B高表达组的患者TB和GGT正常值比例更高。在PD-L1低表达组中，RAB11B高表达，并且具有有明显的负相关性。应用生存分析进一步评估RAB11B在HCC中的预后意义，结果表明RAB11B表达较高的患者表现出更长的OS和DFS，表明RAB11B也可能是HCC发展的保护因素（如图3C-D）。
6.RAB11B相关PPI网络
通过GeneMANIA数据库筛选了20种已确认或预测与RAB11B相互作用的蛋白质，包括GDI1，TBC1D14，EVI5，TBC1D8B，PCSK9，RAB11FIP1，MYO5B，BICDL1，RAB1B，RAB11A等（如图3E）。
7.RAB11B在HCC不同细胞中的表达
使用UMAP可视化来自HPA的单细胞数据。结果表明，RAB11B的mRNA水平在T细胞和肝星状细胞中较高，而在库普弗细胞和红系细胞中较低（如图3F-G）。





8.Lnc-RAB11B-AS1相关基因和功能富集分析
将lnc-RAB11B-AS1共表达基因提交DAVID进行分析，并获得功能注释表。在GO生物过程中，lnc-RAB11B-AS1共表达基因主要参与线粒体ATP合成耦合质子转运、有氧呼吸、线粒体电子转运、NADH向泛醌、透明质酸代谢过程、内肽酶活性负调控、长链脂肪酸代谢过程。在细胞成分中，这些基因与线粒体内膜、血液微粒和细胞外外泌体密切相关（如图4A）。分子功能主要与氧化还原酶活性和NADH脱氢酶（泛醌）活性共同调节。此外，在KEGG分析中，15种信号通路最终显示出统计学意义，包括药物代谢-其他酶，非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）和氧化磷酸化（如图4B），最高的KEGG富集途径通路为“
NAFLD”（如图4C）。
9.GSEA获得的Lnc-RAB11B-AS1相关信号通路
根据lnc-RAB11B-AS1的表达将TCGA-HCC的HCC患者分为两组，差异分析后鉴定出约1721个差异基因，其中612个DEG上调，1109个下调（调整后的p值
10.lnc-RAB11B-AS1和RAB11B表达与免疫浸润细胞的相关性分析
lnc-RAB11B-AS1与包括B细胞在内的6种免疫细胞呈明显负相关，
分别是CD8
T 细胞
， CD4
T
细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞，RAB11B和6种免疫细胞之间具有正相关性（如图5A-B）。HCC中lnc-RAB11B-AS1和RAB11B
的表达水平与多个免疫细胞浸润评分之间具有显著的相关性（如图5C）。进一步表明，lnc-RAB11B-AS1和RAB11B在HCC中的潜在调控机制可能通过影响免疫细胞浸润而生效。
11.HCC中lnc-RAB11B-AS1和RAB11B的交替
从cBioPortal数据库中选择了包含372个样本的数据集（TCGA，PanCancer
Atlas）进行分析。结果表明，RAB11B突变发生率为10%（37/372），而lnc-RAB11B-AS1突变发生率仅为0.3%
(如图5D)。RAB11B
基因改变的肝癌患者的
DFS
明显低于无
RAB11B
基因改变的肝癌患者，但有轻微的显著性变化趋势（如图5E），在HCC组分析中，突变的表达水平与HCC的组织学分级相关（如图5F）。这些发现表明，RAB11B
mRNA的减少可能与HCC的不良预后有关，但仍有待验证。
12.mRNA表达与lnc-RAB11B-AS1甲基化之间的相关性
从UCSC
Xena下载了HCC患者的甲基化数据，获得了位于lnc-RAB11B-AS1启动子区的14个甲基化位点的数据。然后，通过对50对HCC组织和正常组织的比较，筛选出6个具有统计学意义的甲基化位点，包括cg08667721、cg02020019、cg02868306、cg04663720、cg12028991和cg04535340。肿瘤组这些甲基化区域的甲基化水平明显高于正常组（如图5G）。一般来说，启动子区的高甲基化与基因表达呈负相关，lnc-RAB11B-AS1启动子区的高甲基化可能导致转录活性降低，导致其在HCC中的表达降低。通过ciBioPortal数据库的“plots”部分（如图5H-I），发现晚期临床阶段甲基化水平较高，这与之前发现lnc-RAB11B-AS1表达与临床分期呈负相关的结果一致。



13.lnc-RAB11B-AS1和RAB11B靶向miRNA的预测
Lnclocator数据库用于预测lnc-RAB11B-AS1的亚细胞定位，发现lnc-RAB11B-AS1主要定位在细胞质中（如图6A)。使用miRWalk和ENCORI数据库，进一步预测了靶向lnc-RAB11B-AS1和RAB11B的miRNA。结果表明，这两个基因具有五个共同的miRNA：has-miR-4640-5p，has-miR-3918，has-miR-30e-5p，has-miR-30a-5p和has-miR-4726-5p。由于TCGA和GEO中这些miRNA的信息有限，继续在ICGC数据库中进行数据挖掘。观察到HCC组织中的Hsa-miR-4726-5p表达明显高于正常组织中的表达，而其他miRNA的表达状态相反或无统计学意义（如图6B）.
生存曲线显示has-miR-4726-5p高表达的HCC患者预后较差，提示其可能是HCC的潜在危险因素（如图6C）。基于
ENCORI
数据库，我们发现
hsa-miR-4726-5p
与
lnc-RAB11B-AS1呈负相关（如图6D）。hsa-miR-4726-5p
与
RAB11B
呈负相关（如图6E）。因此推断
lnc-RAB11B-AS1作为抗原基因起作用，通过在
HCC
中海绵化
hsa-miR-4726-5p
正向调节其相邻基因
RAB11B。
14.lnc-RAB11B-AS1表达与药物敏感性之间的相关性
选择经过临床试验并获得FDA批准的药物进行药物敏感性分析。数据显示，lnc-RAB11B-AS1与nelarabine、hydroxyurea、pipobroman、thiotepa,
chlorambucil、fluphenazine、triethylenemelamine、uracil
mustard的之间存在从高到低的正相关。然而，当lnc-RAB11B-AS1表达升高时，对dasatinib的敏感性逐渐增加（如图6F），因此推测lnc-RAB11B-AS1可能是HCC靶向治疗的新标志物。